导读

研究背景与目的

猪圆环病毒2型(PCV2)是危害养猪业的重要病原，其基因组包含多个ORF，其中ORF5可通过PERK通路和mTOR通路诱导内质网应激、细胞自噬，并抑制宿主I型干扰素，促进病毒复制。前期研究表明ORF5通过核定位miRNA(miR-30d)上调miR-21水平，抑制PDCD4表达，诱导宿主炎症反应。为系统揭示ORF5诱导宿主炎症反应和免疫抑制的分子机制，本研究围绕竞争性内源RNA(ceRNA)开展深入研究，旨在绘制ORF5与miRNA相互作用的ceRNA网络，为解析PCV2致病机制提供新理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、质粒和毒株

PK-15细胞、PCAGGS-HA-ORF5、PCAGGS-HA-EGFP、PCV2 XY毒株(GenBank: OM249965.1)。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇、异丙醇；PBS；胎牛血清；DMEM培养基；Lipo8000转染试剂；TRIzol；ChamQ Blue Universal SYBR qPCR Master Mix；biotides 10% SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒；HA tag Polyclonal antibody；Dual-Luciferase Reporter Assay System。

1.1.3 主要仪器

QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(Thermo Fisher)；384孔PCR反应板(Life Technologies)；Illumina NovaSeq6000基因测序仪。

1.2 方法

1.2.1 PK-15细胞培养   T25培养瓶，添加10%胎牛血清的DMEM培养基，37°C、5% CO₂培养，单层生长达90%~100%时传代

1.2.2 细胞转染   PK-15细胞按1×10⁶个·mL⁻¹接种于6孔板，单层达50%~70%时，Lipo8000转染PCAGGS-HA-ORF5(2.5 μg·孔⁻¹)，设PCAGGS-HA对照组，每组3个生物学重复。转染后48 h收集细胞，Western blot检测ORF5蛋白表达验证模型

1.2.3 RNA提取和质控   TRIzol提取总RNA，NanoDrop测定浓度，Agilent 5400检查完整性，琼脂糖凝胶电泳分析纯度、降解和污染

1.2.4 荧光定量PCR   DNase I去除DNA，HiScript III All-in-one RT SuperMix反转录500 ng RNA(50°C 15 min，85 °C 5 s)，cDNA稀释至5 ng·μL⁻¹。ChamQ Blue SYBR qPCR Master Mix检测：95°C预变性1 min，40个循环(95 °C 10 s，60 °C 30 s)。检测mRNA(LRRC25、FHIT)、lncRNA(IFIT2、MEGF11)、circRNA(novel-circ-0013507、novel-circ-005901)，2⁻ΔΔCt法计算差异表达倍数

1.2.5 高通量测序和差异RNA分析   RiboZero kit去除rRNA，fragmentation buffer打断，随机引物反转录，dUTP取代dTTP合成cDNA第二链，末端修复、加A、连接接头，USER降解含U的第二链，PCR富集，AMPure XP beads纯化，构建链特异性文库。Illumina NovaSeq6000测序，edgeR软件统计分析，Padj<0.05为差异RNA

1.2.6 GO和KEGG富集分析   DAVID数据库Gene ID Conversion转换差异RNA名称，Functional Annotation进行GO功能聚类和KEGG信号通路分析；GO数据库进行蛋白质家族分析

1.2.7 ceRNA调控网络构建   miRecords和TargetScan Release 8.0预测猪miR-30d-5p或miR-21靶基因；Venny获取靶基因与差异mRNA、lncRNA、circRNA交集(上调miRNA靶基因与下调RNA取交集)；Cytoscape、STRING、PCViz构建RNA调控网络并可视化

1.2.8 双荧光素酶报告基因测定   PK-15接种于96孔板，30%~50%融合度时共转染miR-21野生型/突变型靶基因报告质粒与miR-21拟似物，24 h后检测海肾和萤火虫萤光素酶活性，计算相对活性

1.3 数据分析

GraphPad Prism 10独立样本t检验，x̄±sx表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 RNA质量检测

RNA浓度>200 ng·μL⁻¹，OD_{2600 nm}/OD_{280 nm}≥1.8；琼脂糖电泳可见28S、18S、5S三条带，28S/18S亮度比≈2.0，质量合格（图1）。

2.2 PK-15细胞的转染效率

PCAGGS-HA-EGFP转染后荧光信号证实PCAGGS-HA质粒骨架表达系统有效（图2）。

2.3 PK-15细胞中差异RNA表达情况

Western blot验证ORF5蛋白表达显著升高。高通量测序：ORF5过表达导致131个circRNA(65上调/66下调)、155个lncRNA(68上调/87下调)、2 495个mRNA(1229上调/1266下调)显著变化。qRT-PCR验证：mRNA(FHIT、LRRC25)、lncRNA(IFIT2、MEGF11)、circRNA(novel-circ-0013507、novel-circ-005901)表达趋势与测序一致（图3、表2）。

2.4 PCV2阳性临床样品中差异RNA表达情况

20份PCV2阳性(淋巴结10、肾5、肺5)与20份阴性样品(淋巴结10、口腔液3、肾4、肺2、心脏1)检测，上述差异RNA表达趋势与细胞模型一致（图4）。

2.5 差异RNA的功能富集分析

2.5.1 GO分析    细胞组分：膜蛋白复合物、核内结构、细胞骨架、质膜及相关蛋白复合物、蛋白酶体复合物、内质网膜系统、染色质结构；分子功能：离子跨膜转运、转录调控、酶活性调控、NAD结合、细胞因子活性、金属离子结合、氧化还原酶活性、蛋白激酶活性；生物学途径：转录调控、蛋白质磷酸化修饰、离子跨膜运输、细胞过程调控、蛋白质降解、免疫应答、氧化还原平衡、小分子代谢调控、程序性细胞死亡（图5）。

2.5.2 KEGG分析   三类关键通路：免疫调控：Toll样受体、NOD样受体、B/T细胞受体、IL-1、TNF通路。肿瘤发生发展：RAS/MAPK、TGF-β、细胞周期与凋亡。代谢与神经系统：氧化磷酸化（图6）。

2.6 差异RNA互作网络

以miR-21、miR-30d为关键节点，构建ceRNA网络：高表达circRNA前3：novel_circ_0000782(4.93倍)、novel_circ_0007905(4.86倍)、novel_circ_0012478(4.84倍)；高表达mRNA前3：TTBK1(2.67倍)、HOXA11(3.54倍)、DRD1(5.74倍)；关键分子：miR-30d、miR-21与novel-circ-005901、novel-circ-0013507（图7）。

2.7 双荧光素酶报告基因试验验证circRNA与miR-21结合位点

miR-21显著降低野生型质粒相对荧光素酶活性(P<0.01)，突变型无变化(P>0.05)，证实两种circRNA通过特定位点特异性结合miR-21（图8）。

3 讨论

3.1 GO功能富集与PCV2临床特征关联

膜结合细胞器相关RNA富集→对应PCV2阳性病例细胞空泡化(细胞器功能紊乱是基础)。核糖核蛋白复合体相关RNA富集→ORF5干扰宿主基因转录翻译→免疫相关蛋白合成受阻→临床免疫抑制。。免疫应答、凋亡调控通路富集→解释PMWS免疫低下、细胞凋亡增加的分子依据

3.2 KEGG通路富集与PCV2临床特征关联

TNF通路：炎症核心，ORF5加剧炎症→全身炎症表现。NF-κB通路：调控免疫与凋亡→免疫细胞失调、继发感染。NOD样受体通路：先天免疫关键→削弱病毒识别→持续感染。细胞周期与凋亡通路：干扰细胞周期(如阻滞G1期)、调控凋亡→为病毒复制创造有利环境。FHIT下调→NF-κB抑制减弱→炎症因子失控释放→PCVADs"炎症加剧"(肺脏、淋巴结炎性浸润、发热)；LRRC25差异→IRF3/IRF7激活不足→I型干扰素减少→病毒持续复制+抗炎调节缺失→炎症放大。

3.3 ceRNA网络意义与验证进展

首次从ceRNA角度提出ORF5调控机制：circRNA/lncRNA"海绵吸附"miRNA调控靶mRNA。双荧光素酶验证novel_circ_005901、novel_circ_0013507可通过特定位点与miR-21互作。novel_circ_005901下调→减弱对miR-21抑制→加剧炎症，与前期结论及KEGG富集形成逻辑闭环；novel_circ_0013507与miR-30d潜在关联需进一步验证。ceRNA网络完整功能待基因敲除/过表达试验确认，需结合RIP、FISH技术验证。

3.4 临床验证意义与研究展望

PCV2阳性临床样品验证证实ORF5介导的ceRNA网络是自然感染的真实分子事件。novel_circ_005901特异性下调具备PCVADs诊断标志物潜力(稳定性高、组织特异性强)，或可开发早期诊断试剂，需大样本验证。局限性：ceRNA网络功能未全解析、未纳入其他ORF协同分析、GO/KEGG仅提示关联未验证蛋白调控。未来结合体内动物模型与临床样本完善机制链。

4 结论

PCV2感染通过ORF5干扰PK-15细胞中miRNA、lncRNA、circRNA等多种RNA表达，造成RNA表达紊乱，导致TNF、NF-κB、NOD样受体等炎症相关信号通路及免疫应答、细胞凋亡调控等细胞功能受损，最终导致PCVAD发生。

关键词：猪圆环病毒2型 ; ORF5 ; 转录组学 ; ceRNA网络 ; 非编码RNA ; 免疫调控