《畜牧兽医学报》2026年第57卷第1期刊登了中国农业科学院特产研究所彭海涛, 高阳, 刘雨欣, 顾德媛, 张东, 张如, 许会会, 陈思, 杨艳玲的文章——“布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用”，该文由“十四五”国家重点研发计划(2023YFD1800703;2023YFD1802501);中国农业科学院重大科技任务项目(CAAS-ZDRW202410);吉林省发展与改革委员会基本建设资金产业技术与开发专项(2024C015-3)资助。该研究的创新点:建立了首个基于galU-Omp31双靶标的双重荧光定量PCR方法，实现布鲁菌快速检测与牛种鉴别的"一管双检"，解决了疫苗免疫与自然感染鉴别的关键技术瓶颈
导读
布鲁菌病（布病）是流行广泛、危害严重的人兽共患病，全球16%-25%人口受威胁，年经济损失30-40亿美元。现有疫苗均为弱毒疫苗，牛种布鲁菌A19疫苗在奶牛、肉牛中广泛应用，但疫苗引起的流产及感染人事件时有发生，缺乏有效区分疫苗免疫与自然感染的方法。技术瓶颈：血清学方法（SAT、RBT、ELISA等）存在特异性差、交叉反应、无法鉴别诊断等局限；细菌分离虽为"金标准"，但需BSL-3实验室，难以普及，研究基础：galU基因是布鲁菌高度保守的毒力基因，缺失后可制备新型疫苗；Omp31基因在牛种布鲁菌中永久缺失，可用于区分牛种与其他种布鲁菌。本研究旨在建立一种经济高效、灵敏特异的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，实现快速检测布鲁菌感染的动物及动物产品鉴别区分牛种布鲁菌与其他种布鲁菌，为现有弱毒疫苗及新型galU缺失疫苗提供鉴别诊断技术支撑。
1.1 核酸
布鲁菌核酸由广州医科大学附属市八医院提供，其他细菌核酸由本实验室保存。
1.2 主要试剂和仪器
包括TIANGEN质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂、Vazyme无缝克隆试剂盒等；主要仪器有QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统、NanoDrop微量分光光度计等。
1.3 引物及探针设计和引物特异性初步验证
基于GenBank中galU和Omp31基因序列，利用NCBI primer-BLAST设计三对携同源臂引物及两对特异性引物和探针，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 重组质粒构建与鉴定
以羊种布鲁菌核酸为模板扩增galU、Omp31基因，通过无缝克隆插入pUC19质粒，转化至XL10感受态细胞，经PCR鉴定和测序验证后命名为pUC19-galU&Omp31，计算拷贝数并稀释保存。
1.5 双重荧光定量PCR反应体系优化及标准曲线建立
采用方阵法优化引物（500、250、125 nmol·L⁻¹）与探针（250、125、62.5 nmol·L⁻¹）浓度，确定最佳反应体系；以10倍梯度稀释的重组质粒绘制标准曲线。
1.6 特异性试验
使用羊种布鲁菌、牛种布鲁菌A19株、不动杆菌、产气荚膜梭菌、大肠埃希氏菌、巴氏杆菌等DNA作为模板，验证方法特异性。
1.7 敏感性试验
将重组质粒连续10倍稀释（1.93×10⁰~1.93×10⁴ copies·μL⁻¹）作为模板，检测方法最低检测限。
1.8 灵敏度试验
将羊种布鲁菌、牛种布鲁菌A19株、猪种布鲁菌S2株核酸稀释（1 ng·μL⁻¹~0.1 fg·μL⁻¹），与BCSP31-PCR方法比较灵敏度。
1.9 重复性试验
选取3个浓度重组质粒进行组内（每浓度3次重复）和组间（3个不同批次）重复性试验，计算变异系数。
1.10 样品检测
检测临床采集和实验室制备的156份样品（包括牛血清、鹿血清、羊血清、豚鼠血清及羊脾脏等），与BCSP31-PCR和虎红平板凝集试验进行符合率比较。
2.1 双重TaqMan荧光定量PCR引物特异性初步验证
galU-F/R引物可作为布鲁菌属通用检测引物；Omp31-F/R引物可扩增其他种布鲁菌但无法扩增牛种布鲁菌，可用于鉴别诊断。
2.2 重组质粒pUC19-galU&Omp31构建
成功获得917 bp的galU片段、755 bp的Omp31片段及2698 bp的pUC19线性化片段，测序验证正确，质粒浓度为90.7 ng·μL⁻¹(图1） 。
2.3 双重TaqMan荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线建立
最佳引物浓度500 nmol·L⁻¹、探针125 nmol·L⁻¹；galU标准曲线y=-3.561x+44.069（R²=0.999），Omp31标准曲线y=-3.38x+43.455（R²=0.998）（表2和图2）。
2.4 特异性试验
羊种布鲁菌galU及Omp31均阳性；牛种布鲁菌A19株galU阳性、Omp31阴性；其他细菌均阴性，特异性良好。
2.5 敏感性试验
最低检测限为1.93×10⁰ copies·μL⁻¹。
2.6 灵敏度试验
双重TaqMan荧光定量PCR最低检出浓度0.1 fg·μL⁻¹，显著优于BCSP31-PCR（100 fg·μL⁻¹）。
2.7 重复性试验
组内变异系数0.02%~0.55%，组间变异系数0.6%~1.8%，均小于2%。
2.8 样品检测
52份鹿血清：双重qPCR阳性47份（含1份牛种布鲁菌），与BCSP31-PCR符合率98%，虎红试验符合率29.8%（表3）；15份羊脾脏：双重qPCR全部阳性，BCSP31-PCR阳性9份，符合率60%（表4）；成功鉴别galU基因缺失弱毒疫苗、菌影疫苗及牛种布鲁菌A19疫苗免疫动物（表5）。
3 讨论
现有血清学检测方法存在操作复杂、敏感性不足、交叉反应及无法鉴别诊断等局限。本研究基于galU基因（布鲁菌通用检测）和Omp31基因（区分牛种与其他种）建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法，具有特异性强、灵敏度高（最低检测限1.93 copies·μL⁻¹）、重复性好（CV<2%）等优点。该方法可精准区分自然感染与疫苗免疫（包括galU缺失弱毒疫苗、菌影疫苗及牛种A19疫苗），为动物布病净化提供了重要的技术支撑，较BCSP31-PCR和虎红平板凝集试验更具优势。
本研究成功建立了布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于布鲁菌感染的快速检测、牛种布鲁菌与其他种的鉴别诊断，以及现有疫苗和新型疫苗的鉴别区分，为动物布病精准检测和净化提供技术支撑。
关键词：布鲁菌 ; 双重Taq Man荧光定量PCR ; 检测方法 ; 鉴别诊断
引用本文
彭海涛, 高阳, 刘雨欣, 顾德媛, 张东, 张如, 许会会, 陈思, 杨艳玲.
PENG Haitao, GAO Yang, LIU Yuxin, GU Deyuan, ZHANG Dong, ZHANG Ru, XU Huihui, CHEN Si, YANG Yanling.
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