《畜牧兽医学报》2025年第56卷第8期刊登了中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(北方)等单位时文健, 徐磊, 张泽, 杨蕊, 辛凌翔, 王楠, 陈祥, 鑫婷的文章——“基于结核分枝杆菌牛变种C68001随机突变体库筛选和鉴定成膜相关基因”，该文由十四五重点研发计划(2024YFD1800301)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项课题(2022-YWF-ZYSQ-01)；江苏省人兽共患病学重点实验开放课题(R2211)资助。该研究的创新点:1）利用结核分枝杆菌牛变种C68001的随机突变体库，通过高通量筛选技术成功鉴定出多个影响生物膜形成的关键基因，包括Rv1096、Rv3425、Rv3136和Rv3671c。2）通过构建Rv3671c基因的敲除、回补和过表达菌株，验证了该基因在生物膜形成、抗逆性和细胞内存活中的重要作用，为结核病的防控提供了新的靶点。3）不仅研究了基因对生物膜形成的影响，还综合分析了其对抗氧化、抗SDS、抗酸性和细胞内存活等多表型的影响，全面揭示了Rv3671c基因的功能。4）成功构建了结核分枝杆菌牛变种C68001的突变体文库和微孔板筛选方法，为后续高通量筛选其他表型提供了可靠的技术平台。

 研究背景与目的

结核分枝杆菌牛变种（Mycobacterium tuberculosis variant bovis）是引起牛结核病的主要病原之一，具有广泛的人畜共患性。生物膜的形成增强了分枝杆菌的生存能力和耐药性，使其在宿主体内更难被清除。本研究利用结核分枝杆菌牛变种C68001的随机突变体库，筛选和鉴定与生物膜形成相关的基因，以期发现新的干预靶点。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、噬菌体及主要试剂

主要菌株包括结核分枝杆菌牛变种C68001和耻垢分枝杆菌M. Smegmatis mc 2 155，主要试剂包括7H9和7H10培养基、硫酸卡那霉素等。

1.2 生物膜相关突变株筛选及突变基因位点确定

通过苏通培养基培养突变体库，筛选生物膜表型差异明显的突变株。利用抗性标记挽救法及测序确定突变基因位置。

1.3 抗逆性检测

1.3.1 抗氧化

检测突变基因对菌株抗氧化性的影响，通过过氧化氢处理后菌落计数评估。

1.3.2 抗SDS

检测突变基因对菌株抗SDS性能的影响，通过SDS处理后菌落计数评估。

1.4 结核分枝杆菌牛变种C68001 Rv3671c基因敲除、回补和过表达菌株的构建和鉴定

利用噬菌体系统构建Rv3671c基因的敲除、回补及过表达菌株，并通过PCR及Western blot验证。

1.5 Rv3671c对结核分枝杆菌牛变种C68001的表型影响

1.5.1 成膜性

检测Rv3671c基因对生物膜形成的影响，通过结晶紫染色法评估。

1.5.2 抗氧化

检测Rv3671c基因对抗氧化性能的影响。

1.5.3 抗SDS

检测Rv3671c基因对抗SDS性能的影响。

1.5.4 抗酸性

检测Rv3671c基因对抗酸性能的影响。

1.5.5 胞内存活

检测Rv3671c基因对细菌在小鼠巨噬细胞系J774A.1中的存活性能的影响。

1.5.6 扫描电镜观察细菌形态

通过扫描电镜观察Rv3671c基因对细菌形态的影响。

2 结果

2.1 成膜相关基因筛选鉴定结果

通过抗性标记挽救法鉴定的转座子插入侧翼PCR产物的凝胶电泳结果见图1。筛选到8个生物膜形成缺陷的菌株，其中4个为单基因突变菌株，突变基因分别为Rv1096、Rv3425、Rv3136和Rv3671c。

2.2 突变菌株的抗逆性检测

突变菌株在0.05% SDS和5 mmol·L^-1过氧化氢条件下的存活率，表明Rv1096、Rv3425、Rv3136突变菌株的抗逆性显著降低（图2）。

2.3 结核分枝杆菌牛变种重组菌株构建及鉴定

重组菌株的PCR验证和Western blot鉴定结果证实了Rv3671c基因的敲除、回补和过表达菌株的构建成功（图3、4）。

2.4 Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种的成膜性影响

Rv3671c基因对生物膜形成的影响结果发现，该基因的缺失会损伤生物膜的形成，而过表达则有利于生物膜的形成（图5）。

2.5 Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种的抗逆性的影响

Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种抗SDS和抗氧化性能的影响表明，该基因的缺失显著降低了细菌的抗逆性（图6）。

2.6 Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种的抗酸性和细胞内存活的影响

Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种抗酸性和细胞内存活的影响表明，该基因的缺失显著降低了细菌的抗酸性和细胞内存活能力（图7）。

3 讨论

本研究通过高通量筛选技术成功鉴定出多个与生物膜形成相关的基因，特别是Rv3671c基因。Rv3671c基因在结核分枝杆菌牛变种的生物膜形成、抗逆性和细胞内存活中发挥重要作用。这些发现为结核病的防控提供了新的靶点。

4 结论

本研究利用结核分枝杆菌牛变种C68001的突变体文库，成功筛选出4个生物膜形成显著缺陷的突变株，发现Rv3671c基因对结核分枝杆菌牛变种的生物膜形成具有重要作用。

关键词：结核分枝杆菌牛变种 ; Himar 1转座子 ; 随机插入突变库 ; 生物膜 ; Rv3671c