《畜牧兽医学报》2025年第56卷第7期刊登了中国农业科学院上海兽医研究所等单位耿小玲, 李瑞芳, 徐卫兵, 杜晶莹, 张曼玉, 孙卿, 蒋蔚, 米荣升, 陈兆国, 王权的文章——“弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的构建及其生物学功能研究”，该文由上海自然科学基金(22ZR1476000);上海市科技兴农项目(2022-02-08-00-12-F01085)资助。该研究的创新点:1）成功构建了弓形虫TR与ROP5双基因缺失株，为研究这两个基因在弓形虫致病机制中的协同作用提供了新的模型。2）系统研究了双基因缺失株的体外增殖、入侵能力、体内毒力，以及氧化应激水平和对宿主免疫反应的影响，全面揭示了TR与ROP5基因缺失对弓形虫生物学特性的影响。3）首次探讨了弓形虫TR与ROP5基因缺失株在氧化应激水平变化与宿主免疫反应之间的关联，为理解弓形虫致病机制提供了新的视角。4）通过基因敲除研究，发现TR与ROP5基因对弓形虫毒力和宿主免疫反应的重要作用，为开发新的弓形虫病防治策略提供了潜在的靶点。

研究背景与目的

弓形虫是一种重要的病原体，其感染可导致严重的疾病。本研究旨在通过构建弓形虫TR与ROP5双基因缺失株，研究其生物学表型、氧化应激水平以及对宿主免疫反应的影响，从而深入理解这两个基因在弓形虫致病机制中的作用，为开发新的防治策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验虫株、细胞、质粒及动物

选择特定的弓形虫虫株作为研究对象，确保其具有代表性。使用RAW264.7细胞进行体外试验，该细胞系常用于研究弓形虫的感染机制。构建用于基因敲除的质粒，包括pSAG1::CAS9-U6::sgROP5质粒和pROP5::CAT-D质粒。选择小鼠作为体内实验的模型动物，用于评估弓形虫的毒力。

1.2 试验主要试剂和仪器

用于基因编辑的CRISPR/Cas9系统相关试剂、细胞培养试剂等。仪器设备如显微镜、PCR仪、流式细胞仪等。

1.3 弓形虫的复苏、培养及传代

将保存的弓形虫虫株复苏，使其恢复正常生长状态。在特定条件下培养弓形虫，确保其生长良好。定期传代以维持弓形虫的活性和数量。

1.4 弓形虫ROP5敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定

通过分子克隆技术构建用于基因敲除的质粒。利用酶切、测序等方法验证质粒的正确性。

1.5 弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的构建及鉴定

利用构建的质粒通过同源重组技术实现TR与ROP5双基因的缺失。通过PCR、Western blot等方法验证双基因缺失株的构建成功。

1.6 弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的生物学表型研究

评估双基因缺失株在体外的增殖能力。研究双基因缺失株的噬斑形成能力。

检测双基因缺失株对宿主细胞的入侵能力。通过小鼠模型评估双基因缺失株的体内毒力。

1.7 弓形虫TR与ROP5基因缺失株的脂质氧化(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)及活性氧(ROS)水平的测定

检测脂质氧化水平。评估总抗氧化能力；检测活性氧水平。

1.8 弓形虫TR与ROP5基因缺失株对感染RAW264.7细胞ROS水平的影响

用双基因缺失株感染RAW264.7细胞。分析感染后细胞内ROS水平的变化。

1.9 弓形虫TR与ROP5基因缺失株感染RAW264.7细胞后对RAW264.7细胞NF-κB、IL-12、IFN-γ mRNA表达水平的影响

用双基因缺失株感染RAW264.7细胞。通过qPCR等方法检测NF-κB、IL-12、IFN-γ mRNA的表达水平。

1.10 弓形虫TR与ROP5基因缺失株感染小鼠后对小鼠血清中IL-12的水平影响

用双基因缺失株感染小鼠。检测小鼠血清中IL-12的水平变化。

1.11 生物学统计分析

对试验数据进行统计分析，验证结果的可靠性。

2 结果

2.1 pSAG1::CAS9-U6::sgROP5质粒和pROP5::CAT-D质粒的构建及鉴定

成功构建了pSAG1::CAS9-U6::sgROP5质粒和pROP5::CAT-D质粒；通过酶切和测序验证了质粒的正确性（图1、2）。

2.2 弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的筛选及鉴定

通过抗生素筛选获得双基因缺失株。通过PCR和Western blot验证了双基因缺失株的构建成功（图3）。

2.3 弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的生物活性研究

双基因缺失株的增殖能力显著降低；双基因缺失株的噬斑形成能力减弱；双基因缺失株对宿主细胞的入侵能力降低；小鼠感染实验显示双基因缺失株的毒力显著降低（图4）。

2.4 弓形虫TR与ROP5基因缺失株的氧化应激水平及其分析

双基因缺失株的MDA水平显著降低；双基因缺失株的T-AOC水平显著提高；双基因缺失株的ROS水平显著降低（图5）。

2.5 弓形虫TR与ROP5基因缺失株对感染RAW264.7细胞产生ROS水平的影响及分析

感染后RAW264.7细胞内的ROS水平显著降低（图6）。

2.6 弓形虫TR与ROP5基因缺失株对感染RAW264.7产生NF-κB、IL-12、IFN-γ mRNA水平的影响及分析

感染后RAW264.7细胞中NF-κB、IL-12、IFN-γ mRNA表达水平显著降低（图7）。

2.7 弓形虫TR与ROP5基因缺失株感染小鼠后对小鼠血清中IL-12的水平影响

感染后小鼠血清中IL-12水平显著降低（图8）。

3 讨论

TR与ROP5基因在弓形虫的致病机制中发挥重要作用，其缺失显著影响了弓形虫的生物学表型和致病性。双基因缺失株的氧化应激水平降低，对宿主免疫反应的激活能力减弱，这可能是其毒力降低的原因之一。本研究为深入理解弓形虫的致病机制提供了新的视角，为开发新的防治策略提供了理论依据。

4 结论

本研究成功构建了弓形虫TR与ROP5双基因缺失株，并对其生物学表型、氧化应激水平以及对宿主免疫反应的影响进行了系统研究。结果表明，TR与ROP5基因在弓形虫的致病机制中具有重要作用，其缺失显著降低了弓形虫的毒力和对宿主免疫反应的激活能力。本研究为弓形虫病的防治提供了新的思路和靶点。

关键词：刚地弓形虫 ; CRISPR/Cas9 ; TR ; ROP5 ; ROS