《畜牧兽医学报》2025年第56卷第5期刊登了华中农业大学动物医学院等单位张晓玲, 何兴林, 张梦迪, 李鹏飞, 孙玉梅, 马海龙, 朱红梅, 张梦佳, 李文涛的文章——“猪瘟病毒E2蛋白纳米颗粒的制备及在家兔上的免疫原性分析”，该文由国家现代农业产业技术体系(CARS-35)；影子科技-华中农大健康食品产业研究院项目-猪场重大疫病监测与预警创新平台建设(IRIFH202209)资助。该研究的创新点在于1）新型纳米颗粒疫苗的开发：利用猪瘟病毒E2蛋白，通过293F哺乳动物细胞真核表达系统和原核表达系统，成功制备了E2、E2-pFc、SpyTag-E2和纳米骨架蛋白LS及mi3-SpyCatcher，并组装成LS-E2-pFc NP和mi3-E2 NP纳米颗粒疫苗。2）免疫原性评估：通过在家兔上的免疫试验，评估了不同疫苗组的特异性抗体水平、中和抗体水平、体温变化和脾脏病毒载量。结果显示，LS-E2-pFc NP组在中和抗体水平上表现最佳，且能有效保护家兔免受CSFV攻击。3）鉴别诊断能力：开发的“标记”疫苗能够对自然感染和免疫接种的动物进行鉴别诊断，有助于猪场净化猪瘟，为猪瘟防控提供了新的工具和策略

 研究背景与目的

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性、致死性传染病，严重危害全球生猪养殖业。传统的C株疫苗虽然在一定程度上控制了猪瘟的暴发和流行，但无法进行疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断，给猪瘟的净化带来了困难。因此，开发一种安全、高效且可以进行鉴别诊断的新型猪瘟疫苗具有重要意义。本研究旨在开发一种基于猪瘟病毒E2蛋白的纳米颗粒疫苗，并对其免疫原性进行分析。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞及试验动物

使用的病毒为CSFV C株，细胞包括HEK293T、HEK293F和PK15细胞，试验动物为1.5~2.0 kg的雌性日本长耳大白兔。

1.2 主要试剂

包括CSFV E2蛋白单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG等，佐剂为ISA201，商业化猪瘟E2亚单位疫苗。

1.3 质粒的构建

通过在线分析跨膜区网站预测CSFV E2蛋白的胞外域，保留1-341 aa部分并进行人源密码子优化。构建了pCAGGS-E2、pFRT-E2-pFc和pCAGGS-SpyTag-E2真核表达质粒，以及pCAGGS-LS-protein A质粒。

1.4 真核蛋白的表达与纯化

使用HEK293F细胞表达E2、E2-pFc、SpyTag-E2和LS-protein A蛋白，并通过SDS-PAGE进行检测。

1.4.1 间接免疫荧光(IFA)试验  验证蛋白表达。

1.4.2 Western blot试验   进一步验证蛋白表达。

1.4.3 蛋白的纯化   利用琼脂糖珠进行亲和纯化。

1.5 自组装纳米颗粒的验证

通过透射电镜和动态光散射试验验证纳米颗粒的组装。

1.5.1 透射电镜的观察   观察纳米颗粒的形态和粒径。

1.5.2 动态光散射试验的验证   测定纳米颗粒的粒径分布。

1.6 家兔的免疫及攻毒试验

制备亚单位疫苗并进行免疫保护试验，评估特异性抗体水平、中和抗体水平、体温变化和脾脏病毒载量。

1.6.1 亚单位疫苗的制备   将蛋白与佐剂乳化。

1.6.2 亚单位疫苗的免疫保护试验   对家兔进行免疫和攻毒。

1.6.3 ELISA检测特异性抗体水平   检测血清中特异性抗体。

1.6.4 中和试验检测CSFV中和抗体水平   检测血清中和抗体。

1.6.5 RT-qPCR检测攻毒后脾脏中CSFV病毒载量   检测脾脏中的病毒载量。

1.7 统计分析

使用Graph Pad Prism软件进行显著性分析。

2 结果

2.1 重组质粒在HEK293F哺乳动物真核表达系统中的表达及纯化

成功表达了E2、SpyTag-E2、E2-pFc和LS-protein A蛋白，纯化后的蛋白条带单一，纯度较高（图1，表2）。

2.2 重组质粒mi3-SpyCatcher在原核表达系统中的表达及纯化

成功表达了mi3-SpyCatcher蛋白，纯化后的蛋白条带单一，产量为9.73 mg·L^-1（图2）。

2.3 纳米颗粒的体外自组装验证

透射电镜观察到粒径在10~70 nm的纳米颗粒（图3）。动态光散射试验显示mi3-E2 NP的平均粒径为68 nm，LS-E2-pFc NP的平均粒径为42.4 nm（图4）。

2.4 猪瘟的ELISA抗体检测

免疫10 d后，mi3-E2 NP和LS-E2-pFc NP的抗体阻断率高于E2组（P<0.01），免疫35 d后各免疫组抗体阻断率均在89%以上（图5）。

2.5 猪瘟病毒中和试验

免疫10 d后，E2-pFc组中和抗体水平最高（P<0.001），免疫35 d后LS-E2-pFc NP组中和抗体水平最高（P<0.001）（图6）。

2.6 体温变化

攻毒后，PBS阴性对照组出现典型定型热反应，其余免疫组体温变化不明显（图 7）。

2.7 攻毒后第7天脾脏CSFV拷贝数的测定

E2组有一只兔检出低拷贝的病毒载量，其余免疫组未检到病毒载量（表3）。

3 讨论

本研究成功制备了猪瘟E2、E2-pFc、mi3-E2 NP和LS-E2-pFc NP纳米疫苗，并通过兔体试验验证了LS-E2-pFc NP在诱导产生中和抗体方面的优势。这种“标记”疫苗可以对自然感染和免疫接种的动物进行鉴别诊断，有助于猪场净化猪瘟。未来需要在猪上进行免疫效果评估，并探索最低免疫剂量，同时考虑如何降低生产成本。

4 结论

本研究成功制备了猪瘟E2、E2-pFc、mi3-E2 NP和LS-E2-pFc NP纳米疫苗，并通过兔体试验验证了LS-E2-pFc NP在诱导产生中和抗体方面的优势，为猪瘟亚单位疫苗的研究与应用提供了参考。