《畜牧兽医学报》2025年第56卷第3刊登了中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州大学动物医学与生物安全学院, 动物疫病防控全国重点实验室张越, 茹毅, 郝荣增, 杨锐, 赵陇和, 李亚军, 杨洋, 张荣, 蒋成辉, 郑海学的文章——“非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价”，该文由国家重点研发计划(2021YFD1801302-3)；甘肃省自然科学基金重点项目(23YFNA0011)；中央高校基本科研业务费专项(lzujbky-2022-ct02)；兰州市青年科技人才创新项目(2023-QN-3)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(CAAS-ZDRW202409)；国家生猪产业技术体系(CARS-35)；甘肃省科技重大专项(23ZDKA0002) 资助。该研究的创新点在于1）H108R蛋白的原核表达与纯化：首次成功利用原核表达系统制备了非洲猪瘟病毒H108R蛋白，并通过优化纯化工艺获得了具有高纯度和良好抗原性的重组蛋白。2）免疫原性评价：系统评估了H108R蛋白的免疫原性，发现其能够显著激活小鼠脾脏T淋巴细胞，诱导高水平细胞因子产生，并且制备的多克隆抗体具有高效的病毒抑制能力。3）疫苗候选抗原潜力：为H108R蛋白作为非洲猪瘟亚单位疫苗候选抗原的应用提供了重要理论依据，为非洲猪瘟疫苗的研发开辟了新的方向。
导读
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、高致死性传染病，对全球养猪业造成了巨大损失。尽管ASFV的研究已有百年历史，但由于其复杂的基因组和对病毒与宿主相互作用机制的了解有限，目前仍未有有效的商品化疫苗和药物可用。本研究旨在制备ASFV的H108R蛋白，并通过免疫小鼠评价其免疫原性，为开发基于H108R蛋白的疫苗提供理论依据。
实验动物：6~8周龄雌性BALB/c小鼠，用于免疫试验。
主要试剂和仪器：包括BL21(DE3)感受态细胞、His标签单克隆抗体、亲和层析柱、流式细胞仪等，用于蛋白表达、纯化、免疫和检测。
通过生物信息学工具分析H108R蛋白的氨基酸组成、理化性质、跨膜区、信号肽以及二级和三级结构。
根据生物信息学分析结果，选择H108R蛋白33~108位氨基酸序列进行串联融合，设计并合成基因序列，插入pET-28a原核表达载体中，构建重组质粒pET-H108R。
将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达形式。
采用尿素变性后的菌体沉淀进行纯化，利用Western blot鉴定纯化后的蛋白 。
将重组H108R蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，通过间接ELISA检测血清抗体效价。
Western blot检测：验证多克隆抗体对纯化H108R蛋白的特异性识别。
细胞免疫荧光(IFA)试验：检测多克隆抗体与ASFV-GFP感染细胞的反应性 。
通过流式细胞术检测免疫小鼠脾脏中CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例 。
利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量 。
将H108R多克隆抗体与ASFV-GFP病毒孵育后，观察病毒复制形成的荧光斑点数和病毒基因拷贝数 。
通过对非洲猪瘟病毒H108R蛋白的生物信息学分析，确定了其氨基酸组成、理化性质、跨膜区、信号肽以及二级和三级结构特征：
氨基酸组成 ：H108R蛋白由108个氨基酸组成，分子量为12.614 ku，等电点为5.20，整体呈亲水性（表1）。
跨膜区预测 ：H108R蛋白的10-32位氨基酸为跨膜区（图1）。
信号肽预测 ：H108R蛋白不存在信号肽序列（图2）。
亲疏水性预测 ：蛋白的前35个氨基酸疏水性较强，其余区域亲水性较好（图3）。
二级结构预测 ：主要包含α螺旋（37.96%）、延伸链（17.59%）和无规则卷曲（36.11%）（图4）。
三级结构预测 ：存在较多的α螺旋，与二级结构相似（图5）。
基于以上分析，选择H108R蛋白的33-108位氨基酸序列进行串联融合，用于后续的重组蛋白表达。
重组质粒pET-H108R经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示与预期设计基因大小一致的目标条带（图6），测序结果与设计序列一致，成功构建了含有H108R基因序列的重组质粒。
将重组质粒pET-H108R转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定，结果显示在27 ku左右有一条明显条带，表明重组H108R蛋白主要以包涵体形式存在（图7）。
利用尿素变性后的菌体沉淀进行纯化，成功获得重组H108R蛋白。Western blot鉴定显示，纯化后的蛋白在预期目标位置出现特异性条带（图8），表明成功纯化了H108R蛋白。
2.5 H108R蛋白多克隆抗体的制备及效价测定
通过间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价，结果显示，抗体效价可达1∶128 000（图9），表明H108R蛋白具有良好的免疫原性。
Western blot检测（图10A）：多克隆抗体能够特异性识别纯化的H108R蛋白。
细胞免疫荧光(IFA)试验（图10B）：与阴性血清相比，H108R多克隆抗体在ASFV-GFP感染细胞中显示出特异性红色荧光，表明抗体与病毒具有良好的反应性。
通过流式细胞术检测免疫小鼠脾中CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例，结果显示H108R蛋白免疫后脾中CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例显著升高（图11），表明该蛋白能够有效诱导细胞免疫应答。
2.8 H108R蛋白能诱导机体产生更高水平的细胞因子
利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量，结果显示H108R蛋白免疫能够诱导机体产生更高水平的细胞因子（图12），进一步证明了其免疫原性。
将H108R多克隆抗体与ASFV-GFP病毒孵育后，荧光显微镜观察显示病毒复制形成的荧光斑点数显著减少，定量PCR检测显示病毒基因拷贝数更低（图13），表明H108R多克隆抗体能够有效抑制病毒的复制。
3 讨论
本研究通过生物信息学分析和试验验证，成功制备了H108R蛋白，并证明其具有良好的免疫原性。H108R蛋白能够诱导小鼠脾T细胞的活化，刺激机体产生更高水平的细胞因子，且制备的多克隆抗体能够抑制ASFV-GFP病毒的复制。这些结果表明H108R蛋白具有作为亚单位疫苗候选抗原的潜力，为深入研究其生物学功能及疫苗开发奠定了基础。
本研究成功制备了非洲猪瘟病毒H108R蛋白，免疫小鼠后能够诱导脾T细胞的活化，刺激产生更高水平的细胞因子，制备的多克隆抗体能够抑制ASFV-GFP病毒的复制，具有较好的免疫原性。
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